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06-06
雷锋网消息：近日，瑞士科研团队根据已知的新冠病毒基因序列，通过反向遗传学，在酵母中快速构建了新冠病毒。
活冠状病毒。
据悉，这项技术可以高效合成新冠病毒，特别是在新发疫情病毒被成功分离出来之前，可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒株，而且这种替代方案更加高效、安全。
他的论文《使用合成基因组学平台快速重建 SARS-CoV-2》的结果于 2020 年 2 月 21 日发表在 BioRxiv 上，尚未经过同行评审。
使用反向遗传学构建新病毒有什么意义？公开资料显示，这项研究的科研团队主要是来自瑞士伯尔尼大学的科学家。
他们与德国、俄罗斯等多家科研机构和相关卫生机构合作完成了科研成果。
研究团队认为，利用已知的病毒基因组序列，通过反向遗传学快速构建新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒株的替代方法，还可以对个体基因进行基因改造。
修改和功能表征可以为快速应对疫情赢得时间。
论文提到，反向遗传学被认为是一个不可或缺的工具，可以改变人类对病毒发病机制和疫苗开发的理解。
冠状病毒基因组等大型 RNA 病毒基因组由于其基因组庞大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。
因此，研究需要一个快速、强大的反向遗传学平台。
此次，瑞士研究团队报告了基于酵母的合成基因组学平台，用于多种RNA病毒的基因重建，包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科。
【图片来源：biorxiv 所有者：biorxiv】研究人员利用病毒分离物、克隆病毒DNA、临床样本或合成DNA生成病毒亚基因组片段，然后利用转化耦合重组（TAR）克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体（ YAC），能够在酿酒酵母中进行一步重组。
T7-RNA聚合酶用于产生病毒RNA，病毒RNA又可以产生活病毒。
研究团队首先测试了该平台在其他RNA病毒（如鼠肝炎病毒MHV）中的准确性。
研究小组测试了含有绿色荧光蛋白（MHV GFP）的鼠肝炎病毒A59株的基因克隆能力。
结果显示，所测试的正确组装MHV基因组的YAC占克隆的90%，表明酵母中的病毒组装效率非常高。
也正是利用这个平台，研究人员在获得合成DNA片段后一周内设计并复活了新冠病毒。
值得一提的是，这是一项基于已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作。
这一结果与此前“新冠病毒是人工合成”的谣言之一无关。
本研究中实验室构建的新型冠状病毒是根据疫情爆发后公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。
如何设计并复活新型冠状病毒？ 【图片来源：biorxiv 所有者：biorxiv】具体来说，研究团队将病毒基因组分为12个片段，大小从0.5kbp到3.4kbp不等。
同时，为了便于细胞培养过程中的血清学诊断和追踪，研究团队设计了表达GFP（绿色荧光蛋白）的合成新冠病毒。
因此，研究小组将片段11分成3个含有GFP序列的子片段，将其插入ORF7a（开放阅读框，ORF）中，总共14个片段。
研究团队请试剂公司化学合成了上述14个DNA片段。
他们于 1 月 14 日下了订单，并于 2 月 4 日收到了其中的 12 个片段。
由于一些问题，片段 5 和 7 在大肠杆菌中的克隆未能完成。
然而，研究团队恰巧同时从慕尼黑的一名患者身上获得了新冠病毒样本（SARS-CoV-2/München1.1//），他们决定通过RT-PCR扩增获得片段5和片段5。
7. 利用 TAR 克隆，研究人员获得了能够正确组装所有六种冠状病毒构建体的分子克隆。
然后，研究人员使用转化偶联重组 (TAR) 技术，利用酵母的同源重组系统，根据末端重复序列将这些 DNA 序列拼凑在一起。
获得完整的病毒序列后，研究人员使用T7 RNA聚合酶将DNA序列转录为病毒RNA，并利用电穿孔技术将RNA导入VeroE6（猴肾细胞）中，使细胞感染并培养这些细胞。
将上清液（含有释放的病毒颗粒）注入其他培养基中，可以感染其他细胞。
基于此，瑞士的一个研究小组宣布，他们在获得病毒的合成DNA片段后，仅用一周时间就能够设计并复活最近流行的新型冠状病毒的化学合成克隆。
而且其病毒重组效率高、准确度高。
通常，90% 以上的克隆都是正确的。
值得注意的是，研究人员还指出，虽然之前已经利用酵母中的同源重组克隆了许多分子病毒，但这项研究在通过这种方法快速生成大RNA病毒的全长cDNA方面并不可行。
该病毒的可行性得到了彻底评估，特别是这种大型 RNA 病毒无法在大肠杆菌中稳定克隆。
值得注意的是，除了新型冠状病毒外，研究团队还报道了利用该技术合成构建了MHV（小鼠肝炎病毒，冠状病毒的一种）和MERS-Cov等，同时构建了HCov-E和Zika病毒病毒仍处于实验中期。
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